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核酸電泳新選擇——全自動快速分析核酸
來源: | 作者:201321492800086 | 發布時間: 120天前 | 290 次瀏覽 | 分享到:
核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一,用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段,而電泳的質量直接決定了后續實驗的成敗,實驗室常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一,用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段,而電泳的質量直接決定了后續實驗的成敗,實驗室常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。

瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠作為支持物。瓊脂糖凝膠是一種聚合鏈線性分子含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同,適于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺在在催化物催化條件下聚合形成長鏈,并通過亞甲雙丙烯酰胺交叉連接形成網孔,網孔的大小由丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺的相對比例決定。電泳就是利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離,所以核酸分子帶正電,在電場中向負極泳動;而pH8.0-9.3時,堿基幾乎不解離,而磷酸基團解離,所以核酸分子帶負電,在電場中向正極泳動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此凈電荷對泳動速度影響不大,使得它們能以同樣的速率向正極方向移動。

在一定的電場強度下,DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同,如環形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價閉合環狀的超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA。


瓊脂糖凝膠適合分離長度100bp至20kb的分子,聚丙烯酰胺凝膠對于小片段(5bp-500bp)的分離效果最好。


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瓊脂糖凝膠形成過程


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瓊脂糖凝膠


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丙烯酰胺分子式


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N,N’-亞甲雙丙烯酰胺


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聚丙烯酰胺網狀結構


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聚丙烯酰胺凝膠


影響核酸分子泳動率的因素主要有:

1、樣品的物理性狀

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言,電荷密度越大,泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同,所以對泳動率的影響不明顯。

對線形分子來說,分子量的常用對數與泳動率成反比,用此標準樣品電泳并測定其涌動率,然后進行DNA分子長度(bp)的負對數——泳動距離作標準曲線圖,可以用于測定未知分子的長度大小。

DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大,比如質粒分子,泳動率的大小順序為:cDNA>IDNA>ocDNA。

2、電場強度

電場強度越大,帶電離子的泳動越快,但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,所以電泳時一般采用低電壓,對于大片段分子的話,則需要更小的電壓。

3、緩沖液離子強度

緩沖液pH常偏堿性或中性,此時核酸分子帶負電,向正極移動。電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低時,pH會偏大,緩沖能力減弱,會影響電泳效果。


相信很多實驗人員平時跑電泳的時候會遇到很多問題,配膠步驟繁瑣、染料有毒、分辨率低、電壓選擇不當等都會極大的降低我們的工作效率。隨著科技的發展,其實我們還有其它選擇,那就是毛細管電泳儀,近期中國臺灣Bioptic公司推出了一款便攜式毛細管電泳儀——Qsep1 lite,這款儀器輕巧、簡便、易操作;采用預制膠卡夾、即插即用、安全無毒;檢測快速,最快可達到1分鐘內/樣本;靈敏度可達到pg級別,樣品消耗只需1微升。可用于PCR產物分析、物種遺傳多樣性檢測、核酸質檢、質粒DNA酶切構造及純度分析、文庫質控、RNA質控等多種實驗。


圖片7.jpg

Qsep1 lite


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毛細管電泳原理示意圖


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PCR產物分析對比圖


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RNA質控


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酶切產物


 
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